Специфічність ферменту залежить від його тривимірну структуру що є критичним для його нормального функціонування. Відповідно до гіпотези замка та ключа дії ферменту, тривимірна структура активного центру ферменту дозволяє ферменту легко зв’язуватися лише з певними субстратами.

Найважливішим фактором у визначенні того, чи буде фермент діяти на конкретний субстрат для отримання продукту, є стабільність пов'язаного з ферментом перехідного стану які треба було б сформувати.

Специфічність ферментів залежить від характеристики активного сайту. Це ділянка ферменту, де він зв’язується з субстратом до того, як відбудеться трансформація субстрату.

Ферменти мають унікальна тривимірна форма (3D), і це визначає їхню функцію. Тривимірна форма ферменту визначає орієнтацію амінокислотних залишків відносно один одного, що важливо для активних центрів ферменту. Він також визначає, які типи субстратів можуть зв’язуватися ферментом.

а) Концентрація субстрату визначає специфічність ферменту до свого субстрату.

Специфічність ферменту заснована на можливість вибору тієї чи іншої підкладки, і це молекулярний механізм регуляції. Цього можна досягти лише за наявності подібних форм між субстратом і ферментом, що є структурною комплементарністю.