Вирішіть, який антиген виявляти за допомогою якого флуорофора в багатоколірних експериментах. Найяскравіший флуорофор повинен бути зарезервований для виявлення антигену з найменшим рівнем експресії. Для виявлення найпоширенішого антигену слід використовувати найменший флуорофор.
Флуоресцентні білки, такі як зелений флуоресцентний білок (GFP), стали невід’ємним інструментом для розуміння експресії білків у багатьох наукових дисциплінах. Інші флуоресцентні білки, такі як mCherry та жовтий флуоресцентний білок, також стали широко використовуватися для проточної цитометрії та сортування клітин.
Флюорофор с хороше розділення між максимумами збудження та випромінювання зазвичай забезпечує більш надійне виявлення, ніж флуорофор з невеликим розділенням.
Вибір флуорофорів для імунофлуоресцентного фарбування залежить від:
- Налаштування та обладнання приладу. …
- Ступінь бажаного кольороподілу для багаторазового маркування. …
- Рівень експресії антигену: для виявлення антигенів, що експресуються на низьких рівнях, обирають більш яскравий флуорофор, ніж для високоекспресованих антигенів.
Ефективність флуорофора та його застосування в багатоколірній панелі залежать від таких факторів:
- Профілі збудження та випромінювання.
- Відносна яскравість.
- Квантовий вихід.
- Емісійні перекриття.
- Стабільність кон'югату антитіло-флуорофор.
- Відтворюваність кон'югації антитіл.